往期回顾：
什么是慢病毒
二代和三代慢病毒包装系统的区别及相关辅助质粒
划重点，干货，一定要收藏。
慢病毒载体系统是一种能非常高效的把外源基因稳定整合到哺乳动物细胞中的载体工具。除了常规质粒（如：PCDNA3.1，）转染外，目前该系统也是把外源基因转入哺乳动物细胞的最常用方法之一。由于具有目的基因和启动子选择的灵活性以及转染细胞类型的广泛性两大特点，使得慢病毒载体系统成为倍受欢迎的外源基因表达系统。
慢病毒载体来源于人类免疫缺陷病毒HIV，属于逆转录病毒家族。野生型慢病毒基因组是线性双正链RNA。（科普小知识：HIV攻击的是人类的CD4+T细胞，因为CD4分子是HIV表面糖蛋白gp的受体。）
慢病毒重组载体构建完成后与辅助质粒一起转染进入包装细胞。在包装细胞中，位于两个长末端重复序列（LTR）之间的DNA片段会被转录成RNA，由辅助质粒表达的病毒蛋白将其包装形成病毒颗粒。包装后的活体病毒将会被释放到上清液中，可以直接收集或进一步浓缩病毒转染靶细胞。
当病毒转导靶细胞时，释放到宿主细胞中的病毒RNA借助逆转录酶逆转录成双链DNA，然后随机整合进宿主细胞的基因组中。在病毒载体中，位于两个LTR的DNA片段和病毒基因组都会稳定整合到靶细胞的基因组中。
在慢病毒包装相关辅助质粒一文中，我们有讲诉了，慢病毒包装所需要的质粒：转移质粒（也就是我们目的基因所在的质粒），包装质粒，包膜质粒。
包装质粒，前面已经讲过了，这里就不多讲诉了。
而包膜质粒为什么要换成VSV-G呢？因为HIV攻击的是人类的CD4+T细胞，因为CD4分子是HIV表面糖蛋白gp的受体。这大大限制了病毒的宿主细胞。而换成VSV-G包膜质粒能表达一个异源性糖蛋白，即水泡性口膜炎病毒糖蛋白（VSG-G），该蛋白能与细胞表面广泛存在的磷脂组分而不是一个特异性的细胞表面受体相结合。此类病毒宿主细胞的范围十分广泛，包含的细胞类型例如有神经元，淋巴细胞和巨噬细胞。此外，VSV-G增加了病毒颗粒的物理稳定性，以允许使用高速离心对病毒进行浓缩
接下来主要讲一下转移质粒构建过程所需要的注意点：
在这里找了一个三代慢病毒转移质粒作为例子来叙述，质粒图谱如下：
1、5LTR——3LTR序列之间最好不要加polyA，因为HIV是逆转录病毒，加polyA会影响病毒转录。
2、5LTR——3LTR之间的序列（包含5LTR和3LTR），最好不要超过9.2Kb。这个是慢病毒的最大包装范围，超过会影响病毒的滴度。
3、构建慢病毒表达载体不建议使用CAG这类GC含量比较高的启动子，GC含量过高的启动子会影响慢病毒的包装滴度。
4、Luciferase和EGFP最好不要同时放在一个慢病毒载体上，有数据指数，将两者放在同一个慢病毒载体时，要么Luciferase不能正常工作，要么EGFP观察不到。这种情况下，可以考虑把EGFP换成抗药筛选基因，如Puro。或者是改用红光mcherry。
5、构建慢病表达载体，不建议构建反向表达，反向表达会影响病毒滴度。
6、Cas9+EGFP的组合在同一个慢病毒表达载体中，无论是用2A链接还是分开用不同启动子驱动表达，荧光都比较弱。一般建议采用：Cas9+mcherry；或者是Cas9+抗性基因如：puro。
以上就是构建慢病毒转移质粒过程中所需要注意的事项。
慢病毒转染是随机整合到靶细胞基因组中的，而常规转染如：PCDNA3.1是非整合的。大家需要根据自己的实验目的选择适合的方法。同时，还需要考虑自己的目的基因的大小，是否会超过慢病毒的装载范围。
慢病毒表达的优缺点
优势
外源基因的稳定整合：常规质粒转染只能实现外源基因的瞬时表达，这种外源基因会随着宿主细胞的分裂而不断丢失，在快速分裂的细胞中显得尤为显著。相反的是，慢病毒转导的目的基因能稳定地整合到宿主细胞的染色体中，因而会随着宿主细胞的分裂而稳定遗传。
滴度高：病毒载体可以包装出高滴度的病毒。病毒滴度可以达到TU/ml。在这样的病毒滴度下，如果选择合适的剂量去转导体外培养的哺乳动物细胞，则转导效率可接近%。
宿主范围广泛：病毒包装系统包装出来的病毒含有VSV-G包膜蛋白，此蛋白拥有非常广泛的亲和性，可以转导几乎所有的哺乳动物细胞，包括分裂细胞，非分裂细胞，原代细胞，稳定细胞系，干细胞，分化细胞，贴壁细胞和悬浮细胞等各类哺乳动物细胞，甚至还可以转导一些非哺乳动物细胞。使用传统的转染方式转导神经元细胞是非常难的，但是采用慢病毒载体系统可以轻易的实现神经元细胞的转导。相对于在某些细胞中具有较低转导效率的腺病毒和不能用于非分裂细胞的逆转录病毒而言，慢病毒包装系统包装出来的病毒具有广泛的亲和性。
灵活使用启动子：慢病毒载体经过优化，其5LTR的启动子已进行了自失活。可以灵活使用启动子来驱动目的基因的表达。这相对于只能依赖自身5LTR启动子的MMLV载体来说是一个巨大的优势。
基因拷贝数相对均一：通常情况下，采用病毒转导的方式可以比较均一的将外源基因转入靶细胞中，而传统的质粒转染则呈现出较高的不均一性，导致某些细胞会获得较多拷贝质粒而某些则会获得较少甚至完全没有。
安全性：一、病毒包装和转导所必需的基因由三个辅助质粒分开表达。二、5LTR的启动子自失活。因此，在进行病毒包装和病毒转导的时候不会产生具有复制能力的病毒颗粒，使用慢病毒三代载体对人体的健康威胁也是最低的。
不足之处
载体容量受限：野生型的慢病毒基因组大小约为9.2kb，在慢病毒载体中，病毒包装和转导的必要元件约为2.8kb，余下6.4kb的空间容纳客户的目的序列。当病毒载体超过以上大小限制，病毒的包装滴度将会大大降低。慢病毒载体除了可以插入靶基因的序列外，还可以插入启动子和筛选标记等载体元件。如果目的基因和这些载体元件长度超过了6.4kb，病毒的产量有可能会明显下降。
技术复杂：使用慢病毒载体时，需要在包装细胞中产生活病毒，然后测定病毒滴度。因此慢病毒转染相对于常规质粒转染，技术难度更高，周期更长。
